高(gāo)中教學儀器(qì)廠(chǎng)家(jiā)外(wài)泌體(tǐ)相(x₹‍♠iàng)關特征分(fēn)析

　

掃碼咨詢相(xiàng)關分(fēn)析套路(lù)的(de)研≤♥‌‌究方法

細胞外(wài)囊泡（Extracellular vesicles，EV）可(kě)由↔ ​©細胞産生(shēng)釋放(fàng)的(d&Ωφ§e)具有(yǒu)膜結構的(de)囊泡結→×←構的(de)統稱，根據其大(dà)小(xiǎo)和(hé)生(shēng)物(wù)發生ε♣•(shēng)過程可(kě)分(fēn)為(wèi)以下(xià)四種主要(yào)類型：εβ$外(wài)泌體(tǐ)（Exosomes，30-150nm）、微(wēi)囊泡✔♥∞→（MVs，100-1000nm）、凋亡小(xiǎo)體(tǐ)（a♦§​poptotic body，50-5000nmΩ™）和(hé)癌小(xiǎo)體(tǐ)（oncosomes，1-10μ'☆¥m）。以往的(de)研究表明(míng)，外(wài)÷☆¶☆泌體(tǐ)的(de)來(lái)源細胞種類非常豐富，幾乎在人(rén←✘>≠)體(tǐ)血液、尿液、母乳和(hé)唾液等多(duō)種體(tǐ)液中₽"™✘都(dōu)能(néng)發現(xiàn)它的(de)蹤∑λ↑迹。外(wài)泌體(tǐ)可(kě)以傳遞包括DNA、Rα•☆NA、miRNA、脂質和(hé)蛋白(bái)質在內(nèi)的(de)多(duō)種生 ∑φ£(shēng)物(wù)活性物(wù)質到$♣π→(dào)受體(tǐ)細胞中，同時(shí)<©©保護包裹的(de)內(nèi)含物(wù)免受核酸酶和(hé)蛋白(bái)酶，以及外₽×'(wài)界壞境變化(huà)引起的(de)降解和(hé)變性ε₩ε≠。也(yě)正是(shì)因為(wèi)外(wà∏÷i)泌體(tǐ)來(lái)源廣泛且包含特定細胞群的(de)內(nèi)容物(wù)¶☆↔，還(hái)有(yǒu)其穩定性和(hé)遠(yuǎn)程運輸以及•β≤易獲取的(de)特性，越來(lái)越多(duō)的(de)研究将目光(guāng)©↕聚集在外(wài)泌體(tǐ)的(de)診斷和(hé)預後的(deδ≥)潛力。

那(nà)麽，以外(wài)泌體(tǐ)開(kāi)發新的(de)生(sδ÷hēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)具有(yǒu)哪些(xiē)優勢呢(n÷λe)？①外(wài)泌體(tǐ)本身(shēn)具有(yǒu)特定∑γ•的(de)濃度和(hé)類型，可(kě)以反應個(gè)體(t✔≠ǐ)健康狀況；②包含親代細胞的(de)特定标志(zhì)物±↑(wù)和(hé)內(nèi)含物(wù)，有α☆¥(yǒu)助于鑒定親代細胞的(de)狀态；③外(w©♣↔ài)泌體(tǐ)在外(wài)周循環中的(de)豐富性是(shì)對(duì)已☆&€有(yǒu)檢測鑒定方法的(de)拓展；④外(wài)泌體(tǐ)可(kě)以将其包含生(shēn±→g)物(wù)活性成分(fēn)傳遞到(dào)受體 ←§ε(tǐ)細胞，分(fēn)析內(nèi)含物(wù)種類和(hé)變化(επ♠πhuà)，可(kě)預測受體(tǐ)細胞的(de)變化(huà)。基于以上(s∏±hàng)優勢，開(kāi)發外(wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關準确且穩定的∞₹(de)生(shēng)物(wù)标志(zhìα≠☆Ω)物(wù)對(duì)于臨床上(shàng)£♦的(de)疾病診斷的(de)早期預警具有(yǒu)極大(dà)的(de)推動作(zuò)用(y✘≠ òng)。

目前已經有(yǒu)越來(lái)越多(duō)的(de)研究證明(míng)基于外(¶λ₩wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關RNA鑒定的(de)生(shēng)物(wù)學标志(&✔zhì)物(wù)或者是(shì)開(kā¥∏∑i)發的(de)新的(de)預後風(fēng)險模型均能(néng)夠表現(xiàn)出非常優>≤₩異的(de)疾病診斷和(hé)預後效果。現(xiàn)在就(jiù)跟大(dà)家(jiā)介紹幾↕‌↑$篇關于外(wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關特征的(de)研✘∏☆•究文(wén)章(zhāng)。

外(wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關特征的(de)研究案例：

1.唾液衍生(shēng)的(de)外(wài)泌體(tǐ)小(xiǎ≈₹←αo)RNA作(zuò)為(wèi)食管癌生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)

題目：A signature of saliva-derived>λ→ exosomal small RNAs as predicting biomarker fo₽♥εφr esophageal carcinoma:a multicenter prospective ♥ ©​study

DOI：10.1186/s12943-022-01499-8

食管鱗狀細胞癌(ESCC)在全球癌症發病率和(hé)癌症死亡率方面排名第七，患者在診斷時(shí)₩₽通(tōng)常處于淋巴結轉移的(de)優勢階段，這(zhè)導緻5年(nián)生(shēng↑α'∏)存率約為(wèi)20%。迫切需要(yào)開(kāi)發新的±π(de)生(shēng)物(wù)學标志(zhì)物(wù)應用(yò​↑≤ng)于ESCC患者的(de)早期診斷以↑£☆及更精确的(de)分(fēn)層以指導輔助治療。外(wài)泌體(tǐ)包含tRNA 衍 "生(shēng)的(de)小(xiǎo) RNA (tsRNA)在內(nèi)✘ 的(de)多(duō)種的(de)小(xiǎo)RNA。tRNA衍生(shēng)的(de)βε小(xiǎo)RNA (tsRNA)以核'★酸酶依賴性方式産生(shēng)，以響應癌症中常見(jiàn)的(de)各種壓力。本研究專注于富含βσ癌症的(de) tsRNA 特征，以開(kāi)發基于唾液外(wài)泌₽¶$體(tǐ)的(de)非侵入性生(shēng)物(wù)标志(z÷δ≠>hì)物(wù)，用(yòng)于人(rén)類食管鱗狀細胞≠←✘↔癌 (ESCC)。

采集各3名ESCC患者和(hé)健康志(zα €‌hì)願者的(de)樣本，分(fēn)離(l∑ ∞←í)外(wài)泌體(tǐ)并進行(xín☆≥g)鑒定。測序結果顯示，ESCC患者的(de)外(wài)泌體↔>(tǐ)中鑒定出1366個(gè)差異表達的(de) sesncRNA（不(bù)包₹±括 miRNA）。挑選表達差異最顯著的(de)前五名sesncRNA®₹&進行(xíng)表達檢測驗證，其中tRNA-GlyGCC-5和(hé)s  ₩RESE兩者表達差異P值小(xiǎo)于0.01™¥ ™。使用(yòng)特異性的(de)反義RNAφγ★進行(xíng)轉染，能(néng)顯著抑制(zσ₽ hì)體(tǐ)外(wài)癌症細胞的(de) →φ多(duō)種惡性生(shēng)物(wù)學行(xíng)為(wèi)。

分(fēn)析收集的(de)患者唾液樣本中sesncRNA的(de)水(shuǐ<δ££)平，發現(xiàn)在CHSUMC訓練隊列（200名ESCC患者和(hé)1♣₩20名對(duì)照(zhào)）以及A∞♣TH驗證隊列（140名ESCC患者和(hé)60↓≤$名對(duì)照(zhào)）中均顯示ESCC患者的(de) tRNA-GlyGCC-5和(hé♣ε)sRESE顯著高(gāo)于健康志(zhì)願者。此外(wài♥→)，在 CHSUMC訓練隊列，tRNA-GlyGCC-5和(hé)sRE∏φ→SE的(de)接收者操作(zuò)特征分(fēn)析（AU₩✔π♥ROC）分(fēn)别為(wèi)0.878和(hé)0.871。将tRελ÷φNA-GlyGCC-5和(hé)sRESE的↔↓(de)表達值進行(xíng)邏輯回歸分(fēn)析，建立bi-sesncRNAβδ₽ 特征風(fēng)險評分(fēn)（RSD），ROC分(fēn)析表明(míng)bi-sesnβ♠←↓cRNA簽名RSD比單獨的(de)每個(gè) sesncRN®↓£∞A 具有(yǒu)更好(hǎo)的(de)性能(néng)（AU→∑‍→ROC為(wèi)0.933）。

為(wèi)将雙sesncRNA特征評分(fēn)應用(yòng)在E≠≈SCC預後中的(de)潛在臨床效用(yòng)，基于tRNA-GlyGCC-5、sRESE和(hλ‌♣é)bi-sesncRNA特征RSP的(de)中值對(duì)CHSUMC隊列中的(de)Ω©患者進行(xíng)分(fēn)組。Kaplan-<↔Meier分(fēn)析顯示，在CHSUMC和(hé)ATH隊列中，低(dī)RSP組ESCC€§患者的(de)總體(tǐ)生(shēng™®‍)存期OS和(hé)無進展生(shēng)存期PFS顯著長(cháng)于高(g"©₽āo)RSP的(de)患者。對(duì)比bi-sesncRNA與單獨的(de)sε✘esncRNA的(de)預測結果，發現(xiàn)bi-sesncRNA簽名很(hěn) &​大(dà)程度上(shàng)改善了(le)OS和(hé)PFS的(de)預測。

列線圖預測模型中，CHSUMC隊列和(hé)ATH隊列的(de✘¥₽)3 年(nián)OS預測良好(hǎo)。再次證明(mín≈≤¥₹g)，bi-sesncRNA特征RSP可(kě)以作(zuò)為(wèi)ES¶ ✔CC患者預後的(de)獨立預測因子(zǐ)

同樣基于bi-sesncRNA衍生(shēng)RSP的(de)截止值（-0.436），将ES×" ₩CC患者進行(xíng)分(fēn)組（高(gāo)RSP組和(hé)低π÷ (dī)RSP組）。Kaplan-Meier生(shēng)存分(f'‌ēn)析結果顯示在CHSUMC隊列和(hé)ATH隊列中，隻有(yǒu)高(gā₹‌'φo)RSP亞組在接受輔助治療後患者OS和(hé)PFS能(nαΩ★éng)夠顯著延長(cháng)。

2.循環外(wài)泌體(tǐ)RNA标記是(shì)πλ胰腺癌的(de)潛在診斷标志(zhì)物(wù)

題目：Single-cell analysis oδ↔£"f a tumor-derived exoso☆ ≤me signature correlates with prognosis€δ  and immunotherapy response

DOI：10.1186/s12967-021-03053-4

基于兩個(gè)GSE100232和(hé)GSE1002↓∑€÷06數(shù)據集，對(duì)比胰腺癌患者和(hé)正常樣本中血液外(wài)泌σλ¶體(tǐ)中的(de)RNA的(de)差别。通(​"tōng)過火(huǒ)山(shān)圖可(kě)以看(kàn)出胰δ© 腺癌患者血液中鑒定出大(dà)量差異表達的(de)外(wài)泌體(∑εtǐ)RNA。GSE133684數(shù)據集的(de)分(fēn)析也(yě)驗證了(le)這≠φΩ™(zhè)一(yī)點。

為(wèi)了(le)評估差異循環外(wài)泌體(tǐ)RNA在區(qū≥≈Ω )分(fēn)胰腺癌患者或健康對(duì)照(zhào)的(de)健康狀況方‍★β面的(de)表現(xiàn)，通(tōng)過随機( λjī)森(sēn)林(lín)模型并構建了∞©(le) ROC 曲線，對(duì)顯著差異基因的(de)前10名進行(xíng)歸一(yī)®©©™化(huà)計(jì)數(shù)，曲線下(xià)面積（A∏↓♦☆UC）值為(wèi) 1.0。

胰腺癌患者循環外(wài)泌體(tǐ)中差異表達Rπ§NA的(de)通(tōng)路(lù)富集采用(yòng)IPA通(tōng)路(lù)δ♠ 富集分(fēn)析，結果顯示前五種經典通(tōng)路(lù)，包括氧化↑ (huà)磷酸化(huà)、線粒體(tǐ)功能(néng •÷σ)障礙、sirtuin信号通(tōng)路(lù)、雌激素受體(t≈‌<ǐ)信号通(tōng)路(lù)和(hé)蛋白(bái)質泛素化(huà)通(tōng)路(lù♥☆)。排名靠前的(de)疾病/病症分(fēn)别為(wèi)癌症、機(jī→∑₩≈)體(tǐ)損傷和(hé)異常、傳染病、內(nèi)分(fē©φ‌δn)泌系統疾病和(hé)胃腸道(dào)疾病。差異表達的(d™€e)循環外(wài)泌體(tǐ) RNA 在基因表達、細胞死亡λ↓和(hé)存活、RNA 轉錄後修飾、蛋白(÷™₩bái)質合成和(hé)細胞周期這(zhè)五個(g↕&λè)分(fēn)子(zǐ)和(hé)細胞功能(né£φ₩ng)的(de)五個(gè)主要(yào)特征上(shàng)具有(y↑ β☆ǒu)統計(jì)學意義。網絡分(fēn)析表明(míng)核因子(zǐ)、鋅指和(hé) RNA€• 聚合酶、上(shàng)調癌基因 PVT•£1）。

收集TCGA 胰腺癌 ( n = 179)和(hé)GEPIA匹配正 ©常組織以及胰腺組織（n = 171）驗證循環外(wài)泌體(tǐ)中發現(xi$↑ε₩àn)的(de)差異表達模式對(duì)胰腺癌和(hé)正常組織樣本的←₩εε(de)區(qū)分(fēn)。HIST2H"€™♣2AA3、LUZP6和(hé)HLA-DRA三個(gè)基因 $在胰腺腫瘤和(hé)正常組織之間(jiān​<)存在統計(jì)學差異（p

考慮超過90%的(de)PDAC病例中存在KRAS突變，進±÷一(yī)步探索這(zhè)三個(gè)基  σ因的(de)水(shuǐ)平與KRAS突變狀态的(de)相(xiàng)關性。T↔←₹CGA-PDAC數(shù)據顯示HIST2H2AA3表達水(shuǐ)平在KRAS野Ω§±生(shēng)型和(hé)突變體(tǐ)之間(jiān)差異顯著。

建立HIST2H2AA3、LUZP6和(hé)HLA-DRA的(de)循環外(wài∞σ)泌體(tǐ)RNA特征的(de)ROC曲線¥δ§₹，胰腺癌與健康對(duì)照(zhào)組的(de)AUC為(wèi) 0.8558∞÷$ (95% CI: 0.82–0.89)，胰腺癌與慢(màn)性胰腺炎的(de)AUC為(wèiβ×)0.815 (0.77–0.86) 和(hé)慢(màn)性胰腺炎≤±∞↔與健康對(duì)照(zhào)的(de)AUC值為(wèi)0.58∞÷‌®6 (0.51–0.66)。

3.腫瘤衍生(shēng)外(wài)泌體(tǐ)特征的(de)單細胞分(fēε★×↔n)析與預後和(hé)免疫治療反應相(xiàng)關

題目：Single-cell analysis of a tumor-deri>★ved exosome signature correlates ∑±♦with prognosis and immu ↔&§notherapy response

DOI：10.1186/s12967-0‌φ​¶21-03053-4

結合以前的(de)研究，利用(yòng)PCA算(suàn)法整合™"↓ε腫瘤衍生(shēng)的(de)外(wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關基因，₽φ®定義一(yī)個(gè)新的(de)腫瘤衍生(shēng)外(wài)泌體(tǐ)的(de)÷♠©相(xiàng)關特征（TEXscore）。基于單細胞RNA-seq數(shù)據對(du↕←€¶ì)TEXscore特征進行(xíng)驗證。與三個(gè)✘≈£模塊生(shēng)成的(de)外(wài)泌體(tǐ)相(xiàng)關簽名（Si¶σgnature Score）分(fēn)析₽←<結果一(yī)緻，進行(xíng)性疾病（PD）狀态下(x★↔$ià)的(de)TEXscore顯著高(gāo)于治療前（Pre）和(h₹∑®é)部分(fēn)緩解/疾病穩定（PR/SD） 狀态評分(fēn)。

在 GSE33479 隊列中對(duì)比正常樣本和(hé)癌症樣，TEXs§₩core從(cóng)正常組織到(dào)浸潤性腫瘤樣本保持線性增加。為(wèi)進一(yī)​&>步研究TEXscore與癌症相(xiàng)關性，從(cóngΩ☆δ‍)泛癌中調查驗證腫瘤樣本和(hé)正常組織之間(jiān)的(de)TEXscore水(‍λshuǐ)平差異，結果顯示TEXscore在13種腫瘤的(de)正常和(hé♣εβ )腫瘤樣本中均存在異常顯著的(de)差異，表明(míng)TEXscore與腫瘤αβ≈特征相(xiàng)關。

除了(le)樣本差異，也(yě)對(duì)TEXscorβ₹δe在各腫瘤種預後相(xiàng)關性做(zuò)了(l"‌£e)評估。森(sēn)林(lín)圖和(hé)Kaplan-Meierφ‍§♣ 生(shēng)存分(fēn)析結果表明(mín∞‌g)，TEXscore作(zuò)為(wèi)TCGA數(shù)據集中大(dà)多(∑↔₩±duō)數(shù)癌症類型預後的(de)不(b©∞ù)利因素。在TCGA-LUSC、TCGA-LUAD、T÷®≤CGA-STAD、TCGA-BLCA以及TCGA-Pan-Canc★'er中低(dī)TEXscore組的(de)總體(tǐ)生(shēng)存率更好(hβ$←±ǎo)。

使用(yòng)GEO數(shù)據集（胃癌GSE62254和(hé)肺癌GSE30219）≥±≥×進行(xíng)驗證，分(fēn)析結果基本一(yī)緻。

免疫檢查點阻滞劑（ICB）對(duì)于腫★"♦瘤治療有(yǒu)著(zhe)令人(rén)驚訝的(de) ♥效果，因此也(yě)就(jiù)誕生(shēng)了(le)非常多(duō)的(de♣ )預測性生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)以區(qū)分(fēn)能α★​ (néng)夠受益于ICB治療的(de)患者，但(dàn)是(shì)預測的(de)能'£♥(néng)力卻總是(shì)差強人(rén)意。這∑ (zhè)裡(lǐ)也(yě)以TEXscore對(duì)ICB進行(xíng&φ←)預測分(fēn)析。結果顯示，TEXscore 的(de)預測能(néng)力優于多(✔≥duō)個(gè)效應器(qì)。在分(fēn)析膀胱癌預後中，雖然TEXscore給出的(de)γ↓↕δAUC值并不(bù)理(lǐ)想，但(dàn)是(shì)Kaplan-M≠σ™eier曲線表明(míng)，較高(gāo)的(d≤‍ ¶e)TEXscore與IMvigor210中延長(c‌☆σ↓háng)的(de)存活時(shí)間(jiān)有(yǒu)關。另外(wài)，T≤‌β EXscore也(yě)顯示與腫瘤細胞（TC）中PD-L1水↕✘¶(shuǐ)平的(de)升高(gāo)相(xiàng)關。

使用(yòng) IMvigor210 隊列中高(gāo)和™γ€(hé)低(dī)TEXscore亞組之間(jiān)的(de)DEG進行(xíng)δ≈±功能(néng)富集分(fēn)析。GO§γ←×功能(néng)富集發現(xiàn)高(gāo)TEXscore亞組中上(s∏→hàng)調的(de)基因富集于細胞外(wài)♥ε基質（ECM）重塑相(xiàng)關通(tōng)Ω$™路(lù)。基因集富集分(fēn)析（GSEA）和(hé)KEG$↔∏G分(fēn)析高(gāo)TEXscore亞組中上(shàng)調的(de)基因主要(yào<≠↓≤)富集于腫瘤相(xiàng)關的(de)信号通(tōng)路(lù)§€。

已經證明(míng)TEXscore與免疫抑制(↑★π←zhì)微(wēi)環境之間(jiān)的(de)相(xiε®≠àng)關性。為(wèi)進一(yī)步研究外(wài)泌體✔☆™(tǐ)介導的(de)免疫細胞浸潤模式，整合了(le)涵蓋巨噬細胞、癌症相(&βxiàng)關成纖維細胞（CAF）、髓源性抑制(zσπ₽hì)細胞（MDSC）、上(shàng)皮間('™'jiān)質轉化(huà)（EMT） 和(hé★≈‌)調節性T細胞（Treg） 的(de)綜合免疫抑制(zhì)特征，以表征 TEXscore  ←φ&和(hé)腫瘤微(wēi)環境。TCGA數(sπ$↔☆hù)據集中TEXscore在不(bù)同腫瘤類型的(de)免疫抑制(zhì)微(wē£×"i)環境模式差異較大(dà)，但(dàn)是(shì)TE≠∏Xscore在大(dà)多(duō)數(shù)≠↔¶ 癌症類型中與廣泛的(de)免疫抑制(zhì)特征以及免疫治療抗性&σ×"特征表現(xiàn)出顯著相(xiàng)關性。

大(dà)量研究表明(míng)miRNA&≠δ 作(zuò)為(wèi)外(wài)泌體(tǐ)傳遞的(de)重要(yào)物(ε→>wù)質，廣泛參與腫瘤的(de)發生(shēng)發展。以<αβφTEXscore和(hé)miRNA之間(jiān)的(de)關系為(wèi)出發↕ε↕®點，進一(yī)步研究TEXscore的(de)腫瘤相(xiàng)關性。總計(jì)收 ✔•錄1882個(gè)miRNAs，在高(gāo)TEXscore組中顯示>∑¶±為(wèi)顯著下(xià)調。另外(wài)選擇前10個(g觥γ÷)陰性miRNA下(xià)遊靶基因2628個(gè)用(yòng)↔'♣≈于GO和(hé)KEGG富集分(fēn)析，結果顯示GO功能(néng)富集在神✔€經發生(shēng)過程中，包括軸突形成、突觸組織和(hé)神經元投射等。而∞≠♠₹KEGG富集，除了(le)ECM重塑機(jī)制(zhì)，高(gāo)TEX&∞score組也(yě)表現(xiàn)出與Ras信号通(t☆✔∏ōng)路(lù)、PI3K-Akt信号通(tōng)路(lù)和(¥∏hé) MAPK信号通(tōng)路(lù)等腫瘤惡性通(tōng)路(lù)富集作(zuò≈♦÷)用(yòng)。

TEXscore結合常見(jiàn)基因的(de)基因組譜分(fēn)$ ​£析遺傳突變狀态。TEXscore與TCG≠>•♠A-LUAD隊列中STK11突變率，TCGA-STAD和(h§♦é)TCGA-CESC中的(de)野生(shēng)型TP53負相(xiàng)關。整個≈÷¥¥(gè) TEXscore基因改變率分(fēn)析結果顯示，TCGε™A-LUAD 的(de)高(gāo)TEXscore亞組中觀察到(dào)高(g‍☆āo)EGFR改變頻(pín)率，而低(dī)TEXscore¥<<亞組主要(yào)是(shì)STK11突變，表明(míng)STKβ←11和(hé)EGFR介導對(duì)外(wài)泌≠Ω∞體(tǐ)分(fēn)泌的(de)相(xiàng)反作(zuò)用(yòng)。